Lieu : Centre Broca
Ivana Trivunovic
Equipe Choquet (IINS)
Thesis supervisor: Matthieu Sainlos
Titre
Évolution dirigée et ingénierie de protéine pour l’étude des mécanismes moléculaires de la transmission synaptique
Résumé
Au cours des dernières décennies, les avancées technologiques ont permis de générer une vision plus précise de l’organisation complexe du cytosquelette neuronal et des synapses. Ces progrès vont du développement significatif de différentes techniques d’imagerie aux outils moléculaires actuellement utilisés pour sonder différents compartiments cellulaires et des protéines spécifiques dans les synapses excitatrices. Malgré ces progrès, notre compréhension d’un certain nombre d’éléments structurels et fonctionnels de ces compartiments neuronaux spécialisés est encore incomplète. Les outils développés précédemment, tels que les anticorps synthétiques et les protéines de fusion, doivent encore être améliorés pour parvenir à un sondage structurel et fonctionnel précis et à la modulation des protéines endogènes. Le travail de cette thèse a été consacré à l’exploitation des techniques d’ingénierie des protéines pour obtenir des bibliothèques génomiques hautement diversifiées en utilisant la mutagenèse dirigée et le criblage à haut débit. Ceci permet d’appliquer une pression évolutive sur des bibliothèques contenant des milliards de séquences afin d’identifier les meilleurs candidats liants basés sur le domaine de la 10ème fibronectine humaine. La conception et la sélection de bibliothèques intra-corps se sont concentrées sur deux protéines du cytosquelette, les talines et les spectrines, responsables du développement neuronal ainsi que de la formation et de la stabilisation des synapses. La taline joue un rôle essentiel dans la communication cellulaire avec la matrice extracellulaire et dans le maintien de la stabilité et de l’intégrité cellulaires globales. Elle contient deux domaines fonctionnels distincts, le N-term de FERM et le domaine de tige de la taline. Dans le cadre de ce travail, nous rapportons trois liants hautement spécifiques aux sous-domaines de tige de la taline R1R2, R9 et R11. Les complexes de ces liants avec leurs domaines cibles ont été caractérisés par RMN 2D, fournissant un aperçu détaillé des épitopes de liaison des domaines cibles. Les spectrines créent un réseau protéique très régulier avec des anneaux d’actine à travers la cellule, s’étendant du segment initial de l’axone aux épines dendritiques. Dans ce contexte, de petits domaines de αII-spectrine et de β(II-IV) -spectrine ont été ciblés dans nos sélections, ce qui a donné lieu à plusieurs candidats prometteurs pour l’étude structurelle et fonctionnelle des spectrines. La modulation des interactions protéine-protéine a été axée sur l’inhibition de plusieurs protéines de la région de la densité post-synaptique, impliquées dans le trafic des récepteurs du glutamate, la stabilisation des synapses et la transduction des signaux, afin qu’elles ne se lient pas aux domaines PDZ de PSD95. Cette approche de l’inhibition protéine-protéine du domaine PDZ permettra de bloquer une seule des nombreuses interactions du domaine PDZ et de mieux comprendre la contribution de chaque interaction médiée par le domaine PDZ dans la régulation complexe de la plasticité synaptique. Après une caractérisation complète, ces intrabodies et ces pinces d’affinité fourniront un nouvel ensemble d’outils génétiquement codés pour le marquage et la modulation des protéines endogènes.
Mots-clefs: évolution dirigée, ingénierie des protéines, inhibition des interactions protéiques, conception de sondes d’imagerie, phage display, transmission synaptique
Jury
- Nathalie Sans (University of Bordeaux)
- Arnaud Gautier (University of PSL)
- Gerti Beliu (University of Wuerzburg)
- Matthieu Sainlos (University of Bordeaux)