Corey Butler et al dans Front. Bioinform.

Commentaire

Les méthodes actuelles de suivi de particules uniques (protéines et/ou biomolécules) dans leur environnement ont permis d’identifier et de mieux comprendre de nombreux phénomènes tels que le rôle crucial de l’organisation et de la dynamique des récepteurs membranaires au niveau des synapses entre neurones. En revanche, ces méthodes ne permettent pas de suivre plusieurs populations de molécules différentes simultanément, ce qui serait nécessaire pour mieux comprendre la dynamique temporelle et spatiale des interactions entre différentes populations de protéines.

Dans cet article collaboratif entre les équipes de Jean-Baptiste Sibarita, Vincent Studer et Laurent Groc, une nouvelle méthode instrumentale et computationnelle est proposée permettant de suivre simultanément au cours du temps jusqu’à cinq populations de molécules différentes. Cette approche repose sur un nouveau montage expérimental permettant d’identifier la couleur, ou longueur d’onde d’émission, des particules individuelles détectées sans compromettre ni la résolution spatiale, ni la résolution temporelle des méthodes usuelles mono-couleurs. Pour cela, un second objectif est positionné de l’autre côté de l’échantillon, et le signal collecté est dirigé vers un bras hyper-spectral transformant l’information spectrale en une information spatiale mesurable. Combiné à une approche computationnelle dédiée, ce montage permet de détecter la localisation 3D et la longueur d’onde d’émission de chaque particule détectée. Il devient ainsi possible de suivre au cours du temps plusieurs populations de biomolécules de façon simultanée, et ce même lorsque deux particules se trouvent à une distance inférieure à la limite de diffraction. Cette approche ouvre donc de nombreuses perspectives pour observer directement les interactions entre différentes biomolécules, et ainsi déchiffrer les mécanismes régissant leur organisation et leur dynamique.

Abstract

Single molecule localization (SML) and tracking (SPT) techniques, such as (spt)PALM, (u/ DNA)PAINT and quantum dot tracking, have given unprecedented insight into the nanoscale molecular organization and dynamics in living cells. They allow monitoring individual proteins with millisecond temporal resolution and high spatial resolution (<30 nm) by precisely localizing the point spread function (PSF) of individual emitters and tracking their position over time. While SPT methods have been extended to study the temporal dynamics and co-organization of multiple proteins, conventional experimental setups are restricted in the number of proteins they can probe simultaneously and usually have to tradeoff between the number of colors, the spatio-temporal resolution, and the field of view. Yet, localizing and tracking several proteins simultaneously at high spatial and temporal resolution within large field of views can provide important biological insights. By employing a dual-objective spectral imaging configuration compatible with live cell imaging combined with dedicated computation tools, we demonstrate simultaneous 3D single particle localization and tracking of multiple distinct species over large field of views to be feasible without compromising spatio-temporal resolution. The dispersive element introduced into the second optical path induces a spectrally dependent displacement, which we used to analytically separate up to five different fluorescent species of single emitters based on their emission spectra. We used commercially available microscope bodies aligned one on top of the other, offering biologists with a very ergonomic and flexible instrument covering a broad range of SMLM applications. Finally, we developed a powerful freely available software, called PALMTracer, which allows to quantitatively assess 3D + t + λ SMLM data. We illustrate the capacity of our approach by performing multi-color 3D DNA-PAINT of fixed samples, and demonstrate simultaneous tracking of multiple receptors in live fibroblast and neuron cultures.

Premier auteur

Corey Butler a réalisé son doctorat en collaboration entre l’équipe de Jean-Baptiste Sibarita et la société Imagine Optics. Il a ensuite poursuivi ses travaux dans l’équipe de Jean-Baptiste Sibarita en tant que post-doc avant d’être embauché par la société Abbelight en 2021.

Reference

Multi-Dimensional Spectral Single Molecule Localization Microscopy
Corey Butler^1,2, G Ezequiel Saraceno¹, Adel Kechkar³, Nathan Bénac¹, Vincent Studer¹, Julien P. Dupuis¹, Laurent Groc¹, Rémi Galland^1* and Jean-Baptiste Sibarita^1*

¹ Univ. Bordeaux, CNRS, Interdisciplinary Institute for Neuroscience, IINS, UMR 5297F-33000, F-33000, Bordeaux, France
² Imagine Optic, Orsay, France
³ Ecole Nationale Supérieure de Biotechnologie, Laboratoire de Bioengineering, Constantine, El Khroub, Algeria
^* Co-responsability